烟草脂类合成关键基因NtLPAT的功能验证
吉白璐, 孙艺文, 刘万峰, 钱亚新, 蒋彩虹, 耿锐梅, 刘旦, 程立锐, 杨爱国, 黄立钰, 李晓旭, 蒲文宣, 高军平, 张强, 文柳璎
作物学报
2025, 51 ( 9):
2527-2537.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2025.44216
溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是负责催化溶血磷脂酸(LPA)和脂肪酰基-辅酶A (Acyl-CoA)酯化生成磷脂酸(PA)合成途径的关键酶, 尚不清楚烟草中LPAT的基因功能。本研究从K326中克隆得到NtLPAT基因, 利用CRISPR/Cas9技术获得NtLPAT敲除植株ntlpat, 对其农艺性状和抗病性以及外观质量进行鉴定, 结合脂质组、转录组分析NtLPAT的功能。结果表明, NtLPAT受青枯病菌和黑胫病病菌的诱导。ntlpat株高降低, 对黄瓜花叶病毒病(CMV)与青枯病的抗性提高。脂质组分析表明, ntlpat中甘油酯代谢发生了重排, 三酰甘油含量显著降低, 组成类囊体膜的甘油糖脂含量(MGDG, DGDG)随之上升, 并且鞘脂和磷脂酰肌醇含量也发生变化。转录组分析表明, ntlpat的光合作用、碳固定代谢、鞘脂合成和磷脂酰肌醇信号转导途径的相关基因发生重编程, 因此推测NtLPAT具有脂酰基转移酶活性, 调控三酰甘油的从头合成途径, 并参与细胞信号传导, 影响烟草的生长和对CMV、青枯病菌的抗性, 研究结果为挖掘烟草株型及抗性改良提供基因资源和试验依据。
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图3
ntlpat突变株系脂质组分析图
图A为差异代谢物KEGG分类图; 图B为脂类代谢途径中的差异脂类示意图。TG: 甘油三脂; PG: 磷脂酰甘油; MGDG: 单半乳糖二酰基甘油; DGDG: 二半乳糖二酰基甘油; Cer: 神经酰胺; SPH: 鞘磷脂; PC: 磷脂酰甘油; LPA: 溶血磷脂酸; LPC: 溶血磷脂酰胆碱。
正文中引用本图/表的段落
图A中, M为DL 2000 marker, 1为阴性对照, 2为目的条带。图B为烟草、马铃薯、辣椒与番茄LPAT序列的比对。图C为NtLPAT在烟草不同组织中的表达量, Root: 地下部; Shoot: 地上部; Shoot apex: 苗端。图D为NtLPAT响应黑胫病的表达模式, 0、6、12、24 hpi表示接菌后0、6、12、24 h, R表示烟草抗黑胫品种BH1000-1, S表示感黑胫烟草品种小黄金1025。图E为NtLPAT响应青枯病表达模式, 3、9、24 hpi表示接菌后3、9、24 h, R表示烟草抗青枯品种反帝三号-丙, S表示烟草感青枯品种红花大金元, CK表示未接菌对照, RS表示接种青枯菌。*、**和***分别表示在0.05、0.01和0.001水平差异显著。
利用广靶脂质组学技术分析了K326和ntlpat突变株打顶前中部叶中的脂类成分, 共检测到725个脂质代谢物。有47个代谢物在2个材料中表现出显著差异, 其中23种脂类物质显著上调(FD > 2), 24种显著下调(FD < 0.5)。针对这47个脂质代谢物, 本研究进一步开展了差异代谢物KEGG功能注释及富集分析, 差异脂类物质显著富集于甘油酯及甘油磷脂等代谢路径(图3-A)。作为三酰甘油合成路径中的关键步骤, LPAT催化LPA产生磷脂酸PA, 后续在磷脂酸磷酸酶(PAP)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)的作用下, 生成三酰甘油。脂质组学分析显示, NtLPAT的功能缺失, 影响了烟草三酰甘油的合成, 大量三酰甘油类物质含量相比于对照显著降低, 尤其是不饱和三酰甘油含量显著下降, 例如TG (16∶1_18∶3_18∶3)、TG (16∶1_16∶ 1_20∶5)、TG (16∶1_18∶3_18∶3)等。ntlpat中DGDG和MGDG的含量增加(图3-B), 对应单不饱和和多不饱和DGDG (16∶3_20∶4)、MGDG (16∶1_18∶1)、MGDG (18∶1_18∶1)、MGDG (18∶1_16∶4)的含量增加, 说明多不饱和脂肪酸链的流向从三酰甘油流向了其他脂质, 尤其是参与组建光合作用发生的类囊体膜的甘油糖脂。进一步, ntlpat中组成质膜的脂类成分也发生了改变。在细胞中, 磷脂双分子中的磷脂呈不均匀分布, 质膜的内外两侧分布的磷脂的含量比例也不同。磷脂酰胆碱和鞘磷脂主要分布在质膜外小叶(外层磷脂), 而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸主要分布在质膜内小叶(内层磷脂), 除此之外, 磷脂双分子层还有一些其他磷脂如磷脂酰甘油和磷脂酸分布[26]。ntlpat中多不饱和磷脂酰甘油PG (18∶1_20∶2)、PG (18∶2_18∶2)、PG (18∶1_20∶3)、磷脂酰乙醇胺PE (16∶3_16∶3)的含量上升, 意味着膜脂成分发生非对称变化, 不饱和烃基链对细胞膜的流动性有重要影响, 可以推测ntlpat中的质膜刚性发生了改变。更重要的是, 细胞重要信号分子, 神经酰胺(鞘脂类)磷脂酰肌醇(磷脂类), 其代谢物的活性形式作为可作为第二信使作用的含量也有不同趋势的变化[27-28]。在ntlpat中, 饱和神经酰胺Cer (t18:0/18:0(2OH))、Cer (t18:0/20:0(2OH))、Cer (t17:0/24:0)、Cer (t18:0/18:0)的含量增加, 而含多不饱和烃基链的磷脂酰肌醇PI (16∶0_20∶3)的含量下降, 一方面说明ntlpat信号传导系统发生一系列改变, 另一方面说明ntlpat不饱和烃基连的流向不是随机的。综上说明, 对NtLPAT基因进行突变后, 烟草整个脂类代谢发生了重排。
本文的其它图/表
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图1
NtLPAT基因序列对比以及表达模式分析
图A中, M为DL 2000 marker, 1为阴性对照, 2为目的条带。图B为烟草、马铃薯、辣椒与番茄LPAT序列的比对。图C为NtLPAT在烟草不同组织中的表达量, Root: 地下部; Shoot: 地上部; Shoot apex: 苗端。图D为NtLPAT响应黑胫病的表达模式, 0、6、12、24 hpi表示接菌后0、6、12、24 h, R表示烟草抗黑胫品种BH1000-1, S表示感黑胫烟草品种小黄金1025。图E为NtLPAT响应青枯病表达模式, 3、9、24 hpi表示接菌后3、9、24 h, R表示烟草抗青枯品种反帝三号-丙, S表示烟草感青枯品种红花大金元, CK表示未接菌对照, RS表示接种青枯菌。*、**和***分别表示在0.05、0.01和0.001水平差异显著。
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图2
ntlpat对青枯病抗性鉴定
图A为转基因材料鉴定峰图; 图B为K326与ntlpat接种青枯病菌后14、18、22、25、28、32、35 d时的病情指数; 图C为K326与ntlpat接种青枯0 d与35 d时的烟苗状态。*表示P < 0.05。
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表1
ntlpat株系病毒病抗性分析
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表2
ntlpat突变株系主要农艺性状
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表3
ntlpat突变株系烟叶外观评价
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图4
ntlpat突变株系代谢组分析图
图A为差异表达基因GO富集柱状图; 图B为差异表达基因KEGG富集气泡图; 图C为磷脂合成途径和光合系统复合体差异表达基因示意图。
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