木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选
徐子寅, 于晓玲, 邹良平, 赵平娟, 李文彬, 耿梦婷, 阮孟斌
作物学报
2023, 49 ( 4):
955-965.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2023.24089
Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上, 筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明, 该基因在叶片特异表达, 受干旱、低温负调控, 同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现, MeMYB60可以在保卫细胞表达, 预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中, 具有转录激活活性, 其转录激活结构域在蛋白C端第194~343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1~194氨基酸残基片段为诱饵, 从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白, 酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。
引物名称
Primer name | 引物序列
Primer sequence (5'-3') | 用途
Function | | MeMYB60_SalI_EcoRI_5° | TCGAATTCGAATTCATGGGAAGACCTCCTTGCTGTG | 基因克隆Gene cloning | | MeMYB60-full_BamHI_3° | TAGGATCCGAATATTGGAGACAGTTCCATG | 基因克隆Gene cloning | | MeMYB60_Promoter_PstI_5° | TACTGCAGGGAAGACGAACTCATTGATATC | 启动子克隆Isolation of promoter | | MeMYB60_Promoter_SalI_3° | TCGAATTCACAGCAAGGAGGTCTTCCCAT | 启动子克隆Isolation of promoter | | Me_ACT1_QP1 | GGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGC | 荧光定量PCR qRT-PCR | | Me_ACT1_QP2 | AGTTGCTGACAATACCATGCTCA | 荧光定量PCR qRT-PCR | | MeMYB60_QP1 | CCATTGCAGCACATGACTCGTCATC | 荧光定量PCR qRT-PCR | | MeMYB60_QP2 | CATCTGGGTTCTCCAAGTTATTGTC | 荧光定量PCR qRT-PCR | | MeMYB60-308_BamHI-3° | GAGGATCCCTGCTTCCTGATCTCTGCTGC | 转录激活分析Transcriptional activation assay | | MeMYB60-271_BamHI-3' | GAGGATCCTTTGTCCCATGCAACAGTGTT | 转录激活分析Transcriptional activation assay | | MeMYB60-234_BamHI-3' | GAGGATCCGTAACACTGCAGAGAAGTTGT | 转录激活分析Transcriptional activation assay | | MeMYB60-194_BamHI-3' | GAGGATCCAGGCTTTGGAGATGATCTCAT | 转录激活分析Transcriptional activation assay | | MeCAT1-SalI-5' | TCGTCGACATGGACCCAAGCAAGTTCATTCC | 互作验证Protein interaction assay | | MeCAT1-BamHI-3' | TAGGATCCGAAATTTGGCCTCACGTTGAGAC | 互作验证Protein interaction assay | | MeCAT2-SalI-5' | TCGTCGACATGAGCAACAATCACCCAAGTTCTC | 互作验证Protein interaction assay | | MeCAT2-BamHI-3' | TCGGATCCAAAACTTGGCCTCACATTGAGAC | 互作验证Protein interaction assay |
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表1
PCR引物名称及序列
正文中引用本图/表的段落
气孔是陆地植物与外界环境之间进行气体和水分交换的主要结构, 气孔密度及开闭调节是植物应对干旱胁迫的重要调控方式[13]。模式植物中的研究表明, MYB转录因子在气孔发育及开闭调节过程中均起着重要的作用[1]。例如, 拟南芥MYB类转录因子GTL1可以与SDD1启动子区上的GT顺式作用元件结合, 抑制SDD1基因的转录, 从而控制气孔的发育, 影响气孔密度[14?-16]。最近, 有研究者发现拟南芥AtMYB16的表达直接影响到气孔的分布[17]。MYB转录因子除在气孔发育过程起重要调控作用以外, 在气孔运动调节过程中也起着关键作用。例如, 拟南芥AtMYB60可特异在保卫细胞中表达, 通过调控脂氧化物的合成参与气孔开闭调节, 影响植物抗旱性[18?-20]。拟南芥AtMYB61也可以在保卫细胞中表达, 过表达该基因的拟南芥叶片气孔孔径明显缩小, 对ABA诱导的气孔关闭更加敏感[21]。在干旱胁迫条件下, 拟南芥AtMYB96参与ABA信号传导, 通过调控气孔关闭和表皮腊质合成影响植株的抗旱性[22-23]。
根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中木薯XP_021622445.1编码基因的序列信息, 设计了相应的PCR引物, 用于克隆MeMYB60基因全长片段, 具体引物信息见表1。以木薯cv.60444盆栽苗成熟叶片的cDNA为模板, 以MeMYB60_Sal I_EcoR I_5'和MeMYB60-full_BamH I_3°为引物, 通过PCR克隆了MeMYB60开放阅读框的全长, 并测序验证了全长序列的准确性。
根据从木薯cv.60444中获得MeMYB60基因全长序列信息设计qRT-PCR引物MeMYB60_QP1和MeMYB60_QP2 (表1), 以Phytozome数据库中木薯MeActin1 (Manes.12G150600.1)为内参基因, 设计引物MeACT1_QP1和MeACT1_QP2 (表1)。以各材料的cDNA为模板, 先通过半定量PCR确定MeMYB60基因在木薯叶片、叶柄和根的组织表达特异性, 再通过qRT-PCR分析不同处理条件下MeMYB60基因在木薯叶片中的表达差异。qRT-PCR反应按宝生物公司SYBR Premix Ex Taq II Kit (目录号: DRR081A)操作说明书进行。MeMYB60基因相对表达量以2-ΔΔCt来计算。以GraphPad Prism 6.0软件对数据进行计算分析并作图。
在Phytozome木薯基因组数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/, Manihot esculenta V8.1)中查询MeMYB60 (Manes.09G135700.1)序列信息, 以其编码区起始密码ATG上游1500 bp片段为启动子区, 设计相应引物(表1)。以木薯cv.60444基因组DNA为模板, 利用MeMYB60_Promoter_5'和MeMY B60-full_BamHI_3'引物, 通过PCR方法克隆包括MeMYB60编码区DNA片段和起始密码ATG上游1500 bp的基因组DNA片段, 测序验证序列的准确性。利用MeMYB60_promoter_PstI_5'和MeMYB60_ promoter_SalI_3'为引物克隆MeMYB60启动子, 通过Pst I和Sal I内切酶位点将测序正确后的启动子片段替换植物表达载体35S:MeMYB60:eGFP: pGAMBIA1300上的CMV 35S启动子, 构建MeMYB60-Promoter:MeMYB60:eGFP:pGAMBIA1300载体。经测序正确质粒转化农杆菌GV3101, 随后转化野生拟南芥, 在含潮霉素的1/2 MS固体培养基上筛选转化后的种子以获得阳性植株, 将后代分离比符合3∶1的植株用于启动子活性分析。通过观察GFP蛋白的绿色荧光定位来分析MeMYB60启动子转录调控的组织特异性。
本文的其它图/表
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