木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选
徐子寅, 于晓玲, 邹良平, 赵平娟, 李文彬, 耿梦婷, 阮孟斌
作物学报
2023, 49 ( 4):
955-965.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2023.24089
Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上, 筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明, 该基因在叶片特异表达, 受干旱、低温负调控, 同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现, MeMYB60可以在保卫细胞表达, 预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中, 具有转录激活活性, 其转录激活结构域在蛋白C端第194~343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1~194氨基酸残基片段为诱饵, 从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白, 酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。
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Accession No. | 注释
Annotation | 克隆数
Number of clones | | Manes.13G077148.1 | 细胞色素b6-f 复合体铁硫亚基Cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit | 2 | | Manes.04G085600.1 | 组织蛋白酶F Cathepsin F | 1 | | Manes.14G167100.1 | 捕光复合物ii叶绿素a/b结合蛋白6
Light-harvesting complex ii chlorophyll a/b binding protein 6 | 1 | | Manes.01G009451.4 | 锚重复蛋白35 Ankyrin repeat protein skip 35 | 1 | | Manes.12G158200.5 | 线粒体核糖体蛋白147 Ribosomal protein l47, mitochondrial-related | 1 | | Manes.08G108200.1 | S-腺苷甲硫氨酸合酶4 S-adenosylmethionine synthase 4 | 1 | | Manes.09G074600.1 | ATP依赖RNA解旋酶21 ATP-dependent RNA helicase DDX21 | 1 | | Manes.10G060650.1 | DNAJ同源亚家族A成员2 DNAJ homolog subfamily A member 2 | 3 | | Manes.09G105200.1 | 吡哆醛5’-磷酸合酶PDXs亚基 Pyridoxal 5’-phosphate synthase PDXs subunit | 2 | | Manes.07G116700.1 | 磷酸三糖异构酶 Triose-phosphate isomerase | 1 | | Manes.08G168900.1 | N-末端乙酰转移酶 N-terminal acetyltransferase | 1 | | Manes.06G110100.1 | BRCA1基因1旁蛋白 Next to BRCA1 gene 1 protein | 1 | | Manes.01G011500.2 | 核酮糖二磷酸羧化酶 Ribulose-bisphosphate carboxylase | 1 | | Manes.01G103400.7 | FRNE类蛋白 FRNE protein-like | 1 | | Manes.05G127800.3 | 叶绿体PSBp结构蛋白3 Chloroplastic PSBp domain-containing protein 3 | 2 | | Manes.05G130500.1 | 过氧化氢酶1 Catalase 1 | 1 | | Manes.02G113300.1 | 过氧化氢酶2 Catalase 2 | 1 | | Manes.10G066200.1 | 未知蛋白 Uncharacterized protein | 2 |
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表2
MeMYB60酵母cDNA文库筛选结果
正文中引用本图/表的段落
Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上, 筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明, 该基因在叶片特异表达, 受干旱、低温负调控, 同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现, MeMYB60可以在保卫细胞表达, 预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中, 具有转录激活活性, 其转录激活结构域在蛋白C端第194~343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1~194氨基酸残基片段为诱饵, 从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白, 酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。
在模式植物中及主要农作物中, 针对非生物胁迫相关MYB转录因子功能及调控机制的研究持续受到关注。为挖掘木薯非生物胁迫相关MYB转录因子基因, 本实验室利用PFAM数据库中的MYB保守结构域PF00249 (myb-like DNA-binding domain)对木薯基因组进行BLAST分析(http://www.phytozome.net/), 获得318个具有完整开放阅读框的MYB类基因序列[8]。另外, 部分R2R3-MYB转录因子基因与干旱胁迫条件下木薯叶片的脱落有关[9]。通过全基因组关联分析, 研究人员发现木薯MeMYB26基因可能与木薯叶片宽度有关[10]。随后, 通过目标基因重测序及关联分析证实了MeMYB26与木薯抗旱性显著相关, 是一个潜在的、可用于木薯遗传改良的候选基因[11]。基于基因表达分析结果, 本实验室在转基因木薯中验证了转录因子MeMYB2的抗逆功能, 发现该转录因子基因负调控木薯对干旱和低温的耐受性[8]。进一步研究发现MeMYB2负调控木薯叶片失水率, 并且可以与气孔开闭调节相关蛋白互作[12]。
根据从木薯cv.60444中获得MeMYB60基因全长序列信息设计qRT-PCR引物MeMYB60_QP1和MeMYB60_QP2 (表1), 以Phytozome数据库中木薯MeActin1 (Manes.12G150600.1)为内参基因, 设计引物MeACT1_QP1和MeACT1_QP2 (表1)。以各材料的cDNA为模板, 先通过半定量PCR确定MeMYB60基因在木薯叶片、叶柄和根的组织表达特异性, 再通过qRT-PCR分析不同处理条件下MeMYB60基因在木薯叶片中的表达差异。qRT-PCR反应按宝生物公司SYBR Premix Ex Taq II Kit (目录号: DRR081A)操作说明书进行。MeMYB60基因相对表达量以2-ΔΔCt来计算。以GraphPad Prism 6.0软件对数据进行计算分析并作图。
转录激活结构域分析试验表明, MeMYB60-194蛋白片段对酵母细胞没有毒性, 且该片段无转录激活功能。为了筛选MeMYB60的互作蛋白, 本文以MeMYB60-194蛋白片段为诱饵, 通过酵母双杂交系统从木薯cv.60444成熟叶片cDNA文库中筛选可能与MeMYB60互作的部分蛋白。酵母双杂获得的阳性克隆经2次划线纯化后, 以酵母表达载体pGADT7上的通用引物对不同的单克隆进行菌落PCR。将条带单一且片段在500 bp以上的PCR产物回收并测序。从测序结果中筛选具有完整开放阅读框的序列, 通过BLAST在木薯基因组(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/, Manihot esculenta V8.1)进行比对和注释, 部分结果见表2。从结果中发现, 可能与MeMYB60-194片段互作的蛋白包括2个不同的过氧化氢酶(Catalase), 基因登录号分别为Manes.05G130500.1 (MeCAT1)和Manes.02G113300.1 (MeCAT2)。
转录因子在植物非生物胁迫响应调控中的功能和机制研究持续受到关注。近期, 我们实验室报道了木薯干旱胁迫相关的SPL (SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子MeSPL9在转录水平上负调控茉莉酸、脯氨酸和花青素等干旱逆境响应相关的代谢物关键合成酶基因的表达, 以此影响木薯抗旱性[31]。亚细胞定位及转录自激活试验结果(图4和图7)显示, MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中, 具有明显的转录自激活活性, 表明该基因编码的蛋白可能是一个转录因子。多数MYB转录因子可以与序列为CAACTGG的DNA顺式作用元件结合, 我们前期的研究发现, 木薯MeMYB2可以与上述DNA顺式作用元件结合, 而MeMYB60却不能与该顺式作用元件结合[8]。因此, 木薯MeMYB60所识别并结合的DNA顺式作用元件还需要通过进一步的试验来确定。
本文克隆到了一个在木薯叶片优势表达的R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。干旱、低温以及ABA处理抑制该基因在木薯成熟叶片中的表达, 且MeMYB60启动子可以驱动报告基因在保卫细胞中表达。MeMYB60蛋白主要定位于细胞核中, 其转录激活结构域在第194~234氨基酸残基之间。MeMYB60可能通过与过氧化氢酶互作来调控保卫细胞内的活性氧信号。
本文的其它图/表
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