甘薯PHB基因家族的全基因组鉴定和表达分析
梅玉琴, 刘意, 王崇, 雷剑, 朱国鹏, 杨新笋
作物学报
2023, 49 ( 6):
1715-1725.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2023.24142
蛋白质抑制素(prohibitin, PHB)是在原核生物到真核生物中发现的含有SPFH结构域的蛋白质。植物PHB基因家族参与多种不同生物过程的重要功能, 包括生长发育以及对生物和非生物胁迫的响应。目前PHB蛋白在拟南芥、水稻、玉米、大豆、番茄和陆地棉等多种植物中被鉴定。但对甘薯中PHB家族的系统分析仍未确定。本研究鉴定出甘薯11个PHB基因, 且对这些保守的蛋白质基序和基因结构的分析显示它们在系统发育亚群中具有高度的保守性。此外, 启动子区域预测出与多种激素调节及胁迫相关的顺式作用元件, 同时研究发现IbPHB基因在植物不同部位及受到不同的非生物胁迫时的表达模式存在差异。本研究系统分析了甘薯中IbPHB基因的一般特性, 为甘薯及其他植物中PHB基因的功能特性研究提供了理论基础。
引物用途
Primer function | 引物名称
Primer name | 引物序列Primer sequence | 正向引物序列
Forward sequence (5°-3°) | 反向引物序列
Reverse sequence (5°-3°) | qRT-PCR 扩增
The qRT-PCR
amplification | IbPHB1 | CACGTGTCTGCTTTGGTTCG | TGCTGAGCAACCTGCTTTTG | | IbPHB2 | CTTTGACATTCGCACCAGGC | GCACCCGGAGAGTGAGATTC | | IbPHB3 | GTGGAGAAATGGGGTCGGTT | ACGTCCAGAGAGCAGATCCT | | IbPHB4 | CCACCGCTTCTTCTCCCATT | AGTCATGCCTGGAGCTAGGA | | IbPHB5 | GTCTTCGACGTTTCTCCGGT | TGGCGTACTTCAAGAGGCTG | | IbPHB6 | TCTGGCGAAGAAGAAGGCTG | CTCTGCATCTCTAAGCGCCA | | IbPHB7 | TGCTGCTGCAAGACTTAGGG | TTTGATTCCGCTTCCCCCTC | | IbPHB8 | AGTATAACGCCAGCCAGCTC | GTTGAAGTTAGCCGCCCTCT | | IbPHB9 | GGTGACTCCTTCGCTGTCAA | CCTCCTCTCCAGTAGACCCC | | IbPHB10 | GGCAAGCTGCGAATGAGAAG | CGCGAGGTACTTGGACTCTG | | IbPHB11 | ATGAAGGAAATTGGCGCTGC | GATGGTCAGACTGGGAAGCC | 内参基因
Internal reference genes | β-Actin | AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC | TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC |
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表1
试验所用引物
正文中引用本图/表的段落
抑制素(prohibitin, PHB)是一类从原核生物到真核生物物种中普遍存在的高度保守蛋白, 也被称为 band_7结构域或SPFH (stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C)结构域蛋白[1-2]。PHB家族是植物特有的一类转录因子家族, 广泛存在于绿色植物中, 调控植物生长发育、信号转导及响应非生物胁迫等多种生理过程[3]。PHB基因是1995年在哺乳动物细胞中发现, 由于其具有抗细胞增殖的作用, 是一种潜在的肿瘤抑制基因, 因此被命名为抑制素基因[4]。后在人类中, PHB基因被发现与乳腺癌表型相关[5-6], 其中PHB定位于一些乳腺癌细胞系的细胞核中, 作为一个转录调控因子, 与E2F、P53和视网膜母细胞瘤(Rb)相互作用, 以调节下游基因的表达[7]。因此, PHB基因可以作为一种肿瘤抑制因子, 调节细胞周期进程和细胞凋亡。现已有研究发现, PHB基因在植物发育和衰老中也起着重要作用。PHB3和PHB4是拟南芥中研究最广泛的PHB基因, 它们主要在根和茎的增殖组织中表达[8]。拟南芥突变体AtPHB3表现出严重的生长表型迟缓, 茎部、根部增殖减少, 根尖和根尖细胞分裂下降。过表达拟南芥PHB基因(AtPHB3/AtPHB4)表现出不规则的叶形和广泛的分枝表型。值得注意的是, AtPHB3/4双敲除突变体不能存活, 这表明PHBs在植物发育中发挥了重要作用。在烟草中也得到了类似的结果, NbPHB1和NbPHB2在衰老过程中表达下调。NbPHB2基因沉默导致植株严重的生长延迟、叶片变黄变和细胞死亡[9]。一些研究表明, PHB蛋白不仅在植物发育和衰老中发挥关键作用, 而且在响应盐度、防御和植物激素中也发挥关键作用。例如, 拟南芥eer3-1 (atphb3)突变体在乙烯暴露后表现出黄化的幼苗表型, 各种乙烯诱导基因(拟南芥乙基响应元件结合蛋白(AtEBP), 植物防御素(PDF1.2))的表达受到抑制, 表明AtPHB3在拟南芥中具有双重作用[10-11]。目前, PHB基因家族已在拟南芥(17)、水稻(19)[3]、大豆(24)[12]、番茄(16)[13]、陆地棉(28)[14]和玉米(16)[15]中得到了鉴定。
利用NCBI primer blast 网站和Primer 5软件设计IbPHB基因家族的荧光定量特异性引物(表1), 采用β-Actin作为qRT-PCR的内参基因。参照TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒说明书(北京全式金生物技术有限公司), 在荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96)上进行扩增, 每个反应3次重复。荧光定量PCR 扩增条件为94℃预变性30 s; 94℃变性5 s, 56℃退火30 s, 40个循环; 溶解曲线设置为65℃ 5 s到95℃, 增量为0.5℃。检测IbPHB1~IbPHB11基因在不同组织间的表达模式, 利用2-ΔΔCt法[32]计算出基因的相对表达量。
由图5可知, IbPHB基因的表达具有组织特异性, 除IbPHB3、IbPHB5、IbPHB9、IbPHB10外, 其他基因在甘薯叶片中的表达量最高。IbPHB1和IbPHB7在茎中的表达量高于根, 其他IbPHB基因则是在根中的表达量高于茎。IbPHB3、IbPHB5、IbPHB9、IbPHB10的表达量均为根>茎>叶, IbPHB1在茎和根中的表达量约为叶片中的1/15, IbPHB2在茎和根中的表达量约为叶片中的1/4, IbPHB4在茎和根中的表达量约为叶片中的1/8, IbPHB6在茎和根中的表达量约为叶片中的1/6, IbPHB7在茎和根中的表达量约为叶片中的1/12, IbPHB8在茎和根中的表达量约为叶片中的1/10, IbPHB11在茎和根中的表达量约为叶片中的1/7。
本文的其它图/表
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