玉米小籽粒突变体mn-Mu的基因克隆与转录组分析 作物学报    2023, 49 (11): 3122-3130.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2023.23076

表2 F₂成熟果穗正常和突变籽粒分离比

正文中引用本图/表的段落

玉米籽粒大小是影响产量形成的关键因素。本研究鉴定了一个转座子随机插入的小籽粒突变体mn-Mu; 该突变体相较野生型籽粒变小、种皮皱缩、淀粉含量下降, 而醇溶蛋白含量升高。石蜡切片观察发现mn-Mu突变体胚乳发育迟缓, 胚乳基底转移层细胞发育缺陷。遗传分析表明mn-Mu是由隐性单基因控制的突变, 通过图位克隆将突变基因定位在2号染色体57.83~61.91 Mb的区间, 其中已克隆的编码细胞壁转化酶的Zm00001d003776 (Miniature 1, Mn1)基因在第5个外显子上存在一个1442 bp的转座子插入。等位测试证实, mn-Mu为一个新的Mn1基因等位突变体。转录组分析表明, Mn1基因功能缺失影响碳水化合物代谢、储藏物质积累、糖基转移酶活性、细胞壁生物合成和细胞周期调控等生物学过程。本研究鉴定的新的mn1等位突变体为深入解析籽粒发育的分子调控网络提供了新的遗传材料。

将mn-Mu杂交、回交自交系郑58构建BC₄F₂近等基因材料, 分别取授粉后15 d杂合果穗上共分离的野生型和mn-Mu突变籽粒, 去除种皮后立即在液氮中冷冻并储存于-80℃。将上述样品使用研钵在液氮中研磨成粉末, 取约0.1 g粉末使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN, DP441)用于总RNA的提取。RNA质检、文库构建及转录组测序与分析均委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成。差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)使用R语言edgeR包进行分析, 以表达差异倍数|log₂(Fold Change)|>1和差异显著性P_adj<0.05为标准筛选差异表达基因, 并对差异表达基因进行GO (gene ontology) 功能注释和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

将mn-Mu突变体杂合子与自交系郑58杂交以产生遗传群体, 其F₂代的成熟果穗上面呈现正常籽粒与缺陷籽粒表型3︰1的分离规律(χ2<3.84) (图1-A和表2), 表明mn-Mu为单基因控制的隐性遗传突变。与野生型相比, 成熟的mn-Mu籽粒较小, 胚乳发育不良、胚凹陷, 胚乳外围呈玻璃质, 种皮折皱松散, 且mn-Mu突变体籽粒粒长、粒宽、粒厚相较野生型均降低(图1-B~E), 其百粒重仅为野生型的26.82% (图1-F)。

对授粉后18 d的野生型与mn-Mu突变籽粒取样并进行组织学切片观察, 结果表明野生型籽粒填充饱满, 而mn-Mu突变籽粒较小且胚乳发育不完全, 胚乳与种皮之间存在明显间隙(图2-A, B), 其基底转移层与小穗柄连接不如野生型紧密, 中间出现较大空腔, 且BETL细胞壁内增生发育存在缺陷, 细胞排列紊乱(图2-B, E, F)。此外, mn-Mu突变籽粒中胚体较野生型变小, 但可以正常分化出盾片、叶原基和根原基(图2-C, D)。以上结果表明mn-Mu突变对胚乳发育存在严重影响, 而对胚发育影响较小。

Mn1编码BETL特异表达的细胞壁转化酶INCW2, 已报道的多个mn1突变体均导致籽粒发育缺陷。mn1-1等位基因是由自然突变引起的, 该突变导致Mn1基因表达完全丧失, 授粉后12 d的mn1-1籽粒中总转化酶活性损失98%, 成熟种子重量减少近70% [30]。半显性mn1-89等位基因是由EMS诱导的碱基变化产生, 该碱基变化导致脯氨酸到亮氨酸的替换, 并可能影响INCW2蛋白的稳定性[27]。mn1-89籽粒总转化酶活性损失94%, 种子重量减少33% [13,27]。mn-Mu突变体为Mn1基因第5个外显子上一个转座子插入导致, 该突变体表型与mn1-1相似, 其成熟籽粒较小、种皮折皱呈纸状, 种子重量减少70% (图1), BETL细胞发育缺陷, 细胞壁内增生不明显, 且在胚乳与母体组织维管系统间存在空隙(图2-B)。mn-Mu突变体表现为典型的mn1缺失突变表型, 由于其为转座子插入突变体, 使用PDC1R/PDC2F共显性标记可以方便地鉴定其基因型(图4-C), 相比mn1-1和mn1-89的基因型鉴定更为便捷, 为深入研究Mn1基因功能提供了新的遗传材料。

本文的其它图/表

• 表1 基因定位及克隆引物序列
  
• 图1 玉米mn-Mu籽粒的表型特征
  A: F₁自交成熟果穗; B: 野生型(上排)和mn-Mu (下排)粒长对比; C: 野生型(上排)和mn-Mu (下排)粒宽对比; D: 单粒野生型(左)和突变体(右)籽粒对比; E: 野生型(左)和mn-Mu (右)籽粒纵切; F: 野生型和mn-Mu籽粒百粒重统计。**表示Student’s t检验在0.01概率水平差异显著, 图中标尺为1 cm。
  
• 图2 玉米mn-Mu突变体籽粒的组织学观察
  A: 野生型籽粒, 标尺为1 mm; B: mn-Mu突变体籽粒, 标尺为1 mm; C: 野生型籽粒胚, 标尺为1 mm; D: mn-Mu突变体籽粒胚, 标尺为500 μm; E: 野生型籽粒BETL观察, 标尺为200 μm; F: mn-Mu突变体籽粒BETL观察, 标尺为200 μm。样品为授粉后18 d发育中籽粒。
  
• 图3 玉米mn-Mu突变体籽粒的储藏物质分析
  A: 野生型和mn-Mu籽粒的总淀粉含量测定; B: 野生型和mn-Mu成熟籽粒醇溶蛋白含量对比; C: 野生型和mn-Mu成熟籽粒非醇溶蛋白含量对比。M: 蛋白分子量标记; WT: 野生型; Re1/Re2/Re3代表3个生物学重复。
  
• 图4 玉米mn-Mu的基因定位与克隆
  A: 玉米mn-Mu的图位克隆。n: 定位所用的群体数目, 与InDel标记相对应的数值为交换籽粒数目; B: Mn1基因结构示意图。三角符号代表mn-Mu中转座子插入位置; C: Mn1基因DNA全长扩增。M: DNA分子量标记; WT: 野生型; Z58: 自交系郑58对照。
  
• 图5 mn-Mu突变体与mn1突变体等位测试
  A: mn-Mu/+ × mn1/+杂交果穗表型, 标尺为1 cm; B: mn1/+ × mn-Mu/+杂交果穗表型, 标尺为1 cm。
  
• 图6 玉米mn-Mu突变体转录组测序分析
  A: RNA-seq检测mn-Mu差异表达基因; B: 差异表达基因KEGG富集分析; C: 差异表达基因GO富集分析。