玉米小籽粒突变体mn-Mu的基因克隆与转录组分析
丁孟丽, 王茹茵, 施栋晟, 李莹博, 雷洁, 陈洪宇, 申清文, 王桂凤
作物学报
2023, 49 ( 11):
3122-3130.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2023.23076
玉米籽粒大小是影响产量形成的关键因素。本研究鉴定了一个转座子随机插入的小籽粒突变体mn-Mu; 该突变体相较野生型籽粒变小、种皮皱缩、淀粉含量下降, 而醇溶蛋白含量升高。石蜡切片观察发现mn-Mu突变体胚乳发育迟缓, 胚乳基底转移层细胞发育缺陷。遗传分析表明mn-Mu是由隐性单基因控制的突变, 通过图位克隆将突变基因定位在2号染色体57.83~61.91 Mb的区间, 其中已克隆的编码细胞壁转化酶的Zm00001d003776 (Miniature 1, Mn1)基因在第5个外显子上存在一个1442 bp的转座子插入。等位测试证实, mn-Mu为一个新的Mn1基因等位突变体。转录组分析表明, Mn1基因功能缺失影响碳水化合物代谢、储藏物质积累、糖基转移酶活性、细胞壁生物合成和细胞周期调控等生物学过程。本研究鉴定的新的mn1等位突变体为深入解析籽粒发育的分子调控网络提供了新的遗传材料。
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图4
玉米mn-Mu的基因定位与克隆
A: 玉米mn-Mu的图位克隆。n: 定位所用的群体数目, 与InDel标记相对应的数值为交换籽粒数目; B: Mn1基因结构示意图。三角符号代表mn-Mu中转座子插入位置; C: Mn1基因DNA全长扩增。M: DNA分子量标记; WT: 野生型; Z58: 自交系郑58对照。
正文中引用本图/表的段落
为了克隆mn-Mu突变基因, 我们将mn-Mu/+杂合植株与自交系郑58杂交, 获得F2分离群体用于基因定位。利用240个覆盖玉米10对染色体的InDel标记对突变体DNA池和野生型DNA池进行筛选, 将mn-Mu突变基因初步定位在2号染色体。随后利用F2群体中的587个突变籽粒将目的基因定位到2号染色体57.83~61.91 Mb范围约4.08 Mb大小区间内, 2端分别有1个和3个交换籽粒(图4-A)。基于玉米基因组数据库信息, 该区间内包含已发表的Mn1 (Zm00001d003776), 鉴于mn-Mu与mn1突变体表型相似, 故将该基因作为候选基因并对其进行后续分析。
为了验证mn-Mu突变体是否由Mn1基因突变导致, 我们设计了覆盖Mn1全基因组的2对引物PDC1F/2R和PDC1R/2F, 分别扩增野生型和mn-Mu突变体的Mn1基因片段。PDC1F/2R引物扩增产物大小为1670 bp, 在野生型与mn-Mu突变体间没有差异; PDC1R/2F引物以野生型DNA为模板获得1524 bp大小片段, 而以mn-Mu突变体DNA为模板扩增产物大小为2966 bp (图4-C)。由于mn-Mu为转座子插入突变体, 故对扩增出有差异的产物进行测序分析, 结果表明mn-Mu突变体中Mn1基因的第5个外显子上存在1442 bp的片段插入(图4-B)。序列比对分析表明该插入片段为来源于 Bronze 1座位的转座子。
Mn1编码BETL特异表达的细胞壁转化酶INCW2, 已报道的多个mn1突变体均导致籽粒发育缺陷。mn1-1等位基因是由自然突变引起的, 该突变导致Mn1基因表达完全丧失, 授粉后12 d的mn1-1籽粒中总转化酶活性损失98%, 成熟种子重量减少近70% [30]。半显性mn1-89等位基因是由EMS诱导的碱基变化产生, 该碱基变化导致脯氨酸到亮氨酸的替换, 并可能影响INCW2蛋白的稳定性[27]。mn1-89籽粒总转化酶活性损失94%, 种子重量减少33% [13,27]。mn-Mu突变体为Mn1基因第5个外显子上一个转座子插入导致, 该突变体表型与mn1-1相似, 其成熟籽粒较小、种皮折皱呈纸状, 种子重量减少70% (图1), BETL细胞发育缺陷, 细胞壁内增生不明显, 且在胚乳与母体组织维管系统间存在空隙(图2-B)。mn-Mu突变体表现为典型的mn1缺失突变表型, 由于其为转座子插入突变体, 使用PDC1R/PDC2F共显性标记可以方便地鉴定其基因型(图4-C), 相比mn1-1和mn1-89的基因型鉴定更为便捷, 为深入研究Mn1基因功能提供了新的遗传材料。
本文的其它图/表
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