茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析 作物学报    2020, 46 (10): 1628-1638.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94166

表2 茶树CsHXK2基因启动子的主要顺式作用元件

正文中引用本图/表的段落

植物己糖激酶是双功能蛋白, 具有磷酸化己糖和介导糖信号的关键性作用。前期研究中, 我们从茶树中克隆获得4个己糖激酶基因, 其中CsHXK2基因编码492个氨基酸残基, 与拟南芥AtHXK3、番茄LeHXK4归为Type A类HXKs。利用RT-PCR技术, 克隆获得长度为2029 bp的CsHXK2基因启动子。CsHXK2基因可能受到光照、低温、病原菌、糖和多种激素等信号的调控, 且可能特异性表达于叶、花、种子、根系、腋芽等组织。CsHXK2蛋白定位于叶绿体内。酵母突变体功能互补试验表明, 去除叶绿体转运信号肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶树组织特异性表达分析显示, CsHXK2基因在根和茎中表达量最高, 而在老叶中表达量最低。CsHXK2基因的表达受低温胁迫而显著下调, 经炭疽菌侵染的茶树叶片内CsHXK2基因的表达也受到显著抑制, 而外源赤霉素(GA₃)处理的茶树叶片内CsHXK2基因表达显著上调。本研究结果表明, CsHXK2基因在茶树的生长发育过程和逆境胁迫响应中发挥重要的调控作用。

目前, 对植物己糖激酶的研究主要集中于HXK基因在植物生长发育过程中的作用, 关于其在抗逆胁迫方面的研究则相对较少。组织内超表达拟南芥AtHXK1基因, 植株表现出生长抑制、叶绿素含量减少、光合作用减弱、可溶性固形物和淀粉含量降低、叶片加速衰老以及光合作用相关基因CAB1和RBCS表达下调等现象[15,16]。利用拟南芥葡萄糖非敏感突变体(gin2)研究AtHXK1基因的生理功能[17], 缺乏HXK1葡萄糖催化功能的突变体仍具有多种信号功能, 可调控光合作用基因CAB1和RBCS表达、细胞增殖、根叶生长、开花和衰老等, gin2突变体表现出对生长素(IAA)不敏感而对细胞分裂素2IP超敏感, 表明植物利用HXK为葡萄糖感受体, 使得养分、光照和激素信号网络相互关联, 从而调控植物的生长与发育。通过RNAi技术抑制BnHXK9基因在油菜籽苗内的表达, 植株具有生长迟缓、矮化、叶片卷曲特征, 表明BnHXK9参与植物的生长发育过程[7]。胁迫过程中, NbHXK1、AtHXK1和AtHXK2基因能响应甲基紫精和病原体侵染诱导的氧化胁迫, 高水平的HXK能增强对氧化胁迫的抵抗力[18]; AtHXK2和AtHXKL3基因能在低温、高盐处理下表达上调[14]; 麻风树JcHXK1、JcHXK2和JcHKL1基因在叶片内同样能响应低温而诱导表达[9]; 油菜BnHXK1、BnHXK3和BnHXK9基因能响应核盘菌在抗性品种内的侵染而表达显著上调[7]。

茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我国重要的经济叶用型作物, 在其生长过程中频受低温、干旱、高盐、病原菌等胁迫。因此, 挖掘茶树重要抗性基因、阐明茶树抗逆分子机制、选育强抗逆茶树品种, 是减少环境胁迫造成茶产业经济损失的重要举措。基于HXK基因在拟南芥等植物中的重要作用, 本研究开展了茶树HXK基因的分析研究, 以期获得HXK基因在茶树生长发育及抵御胁迫过程中的生理功能。本课题组前期已从茶树‘龙井43’组织内克隆获得4个己糖激酶基因CsHXK1~ CsHXK4。CsHXK2基因(NCBI登录号为KX159478)的开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为1479 bp, 编码492个氨基酸; CsHXK2蛋白含有叶绿体转运信号肽而不具备跨膜螺旋结构, 且具有保守的ATP结合和糖结合区域, 属于type A类和磷酸化功能活跃的HXK类[19]。本研究进而对CsHXK2基因启动子进行克隆, 并深入分析该段启动子的顺式作用元件构成, 探明该编码蛋白的亚细胞作用位点以及己糖磷酸化活性, 并检测该基因在茶树不同组织器官内以及低温、炭疽菌、赤霉素处理下的表达变化。以期为阐明CsHXK2基因在茶树中的生理功能提供理论依据。

采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测CsHXK2在茶树不同组织器官内和不同处理下的表达情况。基于CsHXK2基因序列[19], 在NCBI的Primer-BLAST网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计CsHXK2 荧光定量引物(表1), 并用常规qRT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性。选用CsPTB作为内参基因[23]; 使用LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂和LightCycler 480 II仪器(Roche, 瑞士)进行qRT-PCR反应。采用2-?CT或2-??CT法[24]计算该基因相对表达水平。

利用New PLACE数据库分析该段2029 bp序列所含的关键顺式作用调控DNA元件。由表2可知, 该启动子含有多种调控茶树响应外在信号的顺式作用元件, 如感知光照、热击、氧气、病菌、创伤、低温、干旱的响应元件, 即-10PEHVPSBD、GATABOX、CCAATBOX1、CURECORECR、ELRECOREPCRP1、LTRE1HVBLT49、MYCCONSENSUSAT等; 如响应生长素、细胞分裂素、水杨酸、乙烯、赤霉素、脱落酸的作用元件, 即ARFAT、ARR1AT、ELRECOREPCRP1、ERELEE4、GARE1OSREP1、MYB1AT等; 多个糖信号响应元件, 即MYBGAHV、SREATMSD、SURE1STPAT21、WBOXHVISO1; 且有ARF、Dof、WRKY、MYB、MYC、RAV1转录因子结合位点, 即ARFAT、DOFCOREZM、ELRECOREPCRP1、MYB1AT、MYCCONSENSUSAT、RAV1AAT等。此外, 还具有调控叶肉、种子、花、根系、腋芽、保卫细胞组织基因表达的元件, 即CACTFTPPCA1、CANBNNAPA、CARGATCON SENSUS、RHERPATEXPA7、SREATMSD、TAAAGSTKST1等。说明茶树CsHXK2基因启动子具备多种调控作用元件, 可能通过参与糖代谢和转导糖信号而调控茶树的生长发育以及逆境胁迫应答。

将携带35S::sGFP和35S::CsHXK2::sGFP载体的农杆菌注射至烟叶片内。经显微镜观察发现, 注射空载体的叶片在细胞质、细胞膜、细胞核内均具有GFP绿色荧光信号(图2-A, C); 含有CsHXK2融合GFP蛋白的叶片, 细胞内的绿色荧光(图2-D)可以与叶绿素自发红色荧光(图2-E)相互重叠, 呈现出黄色荧光信号(图2-G)。随后, 我们将去除N末端叶绿体转运肽的CsHXK2蛋白融合GFP表达载体(即35S:: CsHXK2-cTP::sGFP)注射至含有RFP核定位marker的烟草叶片内发现, 含有CsHXK2-cTP融合GFP蛋白的叶片与含有空载体的叶片所发射的绿色荧光信号具有相同的来源(图2-L, O, H, K), 即来源于细胞质、细胞膜、细胞核。表明CsHXK2蛋白定位于叶绿体, 且其蛋白质序列上存在的N末端叶绿体转运信号肽对其定位起到了决定性的作用。

本研究利用qRT-PCR检测了茶树品种‘龙井43’春季和秋季不同组织中CsHXK2基因的表达情况, 并用TPIA数据库[25]获取了CsHXK2基因在茶树品种‘舒茶早’不同组织器官内的表达水平(图4)。‘龙井43’春季组织中, CsHXK2基因表达量在根系中最高, 其次在茎中; 此外, 其表达量随着顶芽生长发育至第三叶而显著性上升; 但在老叶中呈现出最低表达量(图4-A)。‘龙井43’秋季组织中, CsHXK2基因同样在根系内表达量最高, 其次在茎和未绽放的花蕾中, 3个组织内的表达量无显著性差异; CsHXK2基因在腋芽内的表达量显著性高于顶芽, 而在老叶和盛开的花中表达量最低(图4-B)。CsHXK2基因在‘舒茶早’各组织器官内的表达水平呈现出与‘龙井43’组织内相似的表达特异性, 即表达量在根系中最高, 其次在茎中, 而在老叶中最低(图4-C)。表明CsHXK2基因在茶树源库组织内均具有一定的作用, 尤其在库组织根和茎的生长发育和物质代谢中起到重要的作用。

对茶树品种‘龙井43’、‘大面白’、‘浙农12’和‘浙农113’自然冷驯化(越冬期)和脱驯化过程中的CsHXK2基因表达情况的分析发现, CsHXK2基因在4个不同茶树品种内具有相似的表达模式, 且在‘龙井43’、‘浙农12’和‘浙农113’内的表达随着环境气温的降低(2017.12.18, 2018.01.12)[26]而显著下调, 并随着气温的升高(2018-03-27)而显著上调(图5-A)。室内4℃低温处理能显著降低茶树叶片内CsHXK2基因的表达量, 且随着处理时间的延长而逐渐降低; 而CsHXK2基因的表达水平随着处理温度恢复至25℃而快速上升至处理前表达量(图5-B)。表明CsHXK2基因的表达受到低温的抑制。

采用有伤接种的方式, 对‘龙井43’叶片进行针头刺伤后分别喷施ddH₂O和炭疽菌孢子悬浮液, 取样后检测CsHXK2基因的表达变化。由图5-C可知, 在刺伤喷洒ddH₂O和炭疽菌的叶片中, CsHXK2基因的表达均随着处理时间延长至24 h而显著下调; 在24 h时间点, 炭疽菌处理叶片内的CsHXK2基因表达量显著低于对照。表明CsHXK2基因响应炭疽菌生物胁迫侵染而抑制表达。

对盆栽‘龙井43’叶片分别喷洒ddH₂O和50 μmol L-1 GA₃, 处理后取样并进行CsHXK2基因表达分析。喷洒ddH₂O叶片内的CsHXK2基因表达无显著性变化; 而50 μmol L-1 GA₃处理的叶片内, CsHXK2基因表达量在第3天和第5天显著上升, 且显著高于同一时间点的对照(图5-D)。说明CsHXK2基因参与响应赤霉素信号转导途径。

拟南芥AtHXK3基因在根和种子(长角果)中具有相对丰富的表达量[10,14]; 水稻OsHXK4基因在根、花、幼嫩种子内的表达量明显高于叶片, 且在胚乳内的表达显著高于种皮[12]; 烟草pNtHXK2::GUS活性可在淀粉鞘、木质部薄壁组织、保卫细胞和根尖组织中被检测到, 而在成熟花药内无活性[28]; 质体定位的番茄LeHXK4编码基因可在非光合作用库组织内表达, 包括根、茎、花、绿果、粉果、红果[29]。与同为type A类的AtHXK3、OsHXK4、NtHXK2、LeHXK4基因组织表达特异性相似, CsHXK2基因在茶树的根、茎、嫩叶(芽)、花、腋芽内具有较高的表达量(图4)。这可能归因于CsHXK2基因启动子上具有的根(RAV1AAT和RHERPATEXPA7)、花(CARGATCONSENSUS和POLLEN1LELAT52)、叶肉(CACTFTPPCA1)以及腋芽(SREATMSD)特异性表达元件(表2)。说明CsHXK2基因主要在茶树根、茎等库组织的生长发育中发挥作用, 可能通过磷酸化质体内的葡萄糖和果糖而促进糖代谢, 进而为组织生长发育提供能量和中间代谢物。

茶树原产于热带及亚热带地区, 性喜温暖, 冬季低温和春季倒春寒是威胁茶叶生产的主要气候因素。处于温暖湿润的茶树叶片极易感染由炭疽菌而引发的茶炭疽病, 造成茶叶品质及产量降低。自然冷驯化低温条件下, 茶树叶片内可溶性总糖、蔗糖、葡萄糖及果糖含量显著上升[30,31]。同样, 经炭疽菌侵染的植物叶片内总可溶性碳水化合物、蔗糖、己糖含量明显积累[32,33]。增加的可溶性糖, 包括葡萄糖和果糖, 既能参与细胞内碳和能量代谢, 又能作为信号分子而参与调控植物胁迫响应和生长发育[34]。本研究中, CsHXK2基因在低温及炭疽菌处理后叶片内的表达情况表明, 该基因响应低温及炭疽菌胁迫而表达显著下调(图5-A~C)。拟南芥AtHXK3基因响应低温、渗透和盐胁迫而在根系或嫩梢组织内表达降低[14]; 同样为type A类的麻风树JcHXK2基因, 在低温处理24 h的叶片内表达上调, 而在根系内表达下调[9]。因此, 感应低温和炭疽菌而表达抑制的CsHXK2基因是如何参与调节茶树适应外在刺激, 仍有待深入研究。

赤霉素(GA₃)作为一种植物激素, 参与调控多种生长发育过程。赤霉素信号途径与糖信号之间存在着紧密关联, 其中HXKs是激素与糖联系的一个关键元件。离体矮牵牛花冠内, GA₃对赤霉素诱导基因gip (gibberellin-induced gene)和查尔酮合成酶基因chs (chalcone synthase gene)表达的诱导受到葡萄糖的促进, 但这种葡萄糖引起的促进效果可以被HXK竞争性抑制剂甘露庚酮糖所完全摧毁, 表明HXKs参与的糖磷酸化相关信号转导与赤霉素信号相互作用, 进而诱导矮牵牛花冠发育过程中的基因表达和花青素积累[35]。阿洛糖作为葡萄糖的差向异构体, 能强烈抑制水稻赤霉素依赖性反应, 如第二叶鞘的伸长以及无胚半稻种子α-淀粉酶的诱导, 也能抑制具有赤霉素组成型响应表型的slr1水稻突变体的生长, 而这些抑制能被HXK抑制剂甘露庚酮糖所阻止, 表明阿洛糖通过HXK依赖途径抑制赤霉素信号传导[36]。本研究检测GA₃处理的茶树叶片内CsHXK2基因的表达发现, 该基因转录本在处理样品中有显著的诱导富集(图5-D)。表明茶树赤霉素信号途径和CsHXK2基因表达关系密切, 可能与HXK介导的糖信号途径共同调控茶树的生长发育与逆境胁迫响应有关。

本文的其它图/表

• 表1 引物信息
  
• 图1 茶树CsHXK2基因启动子扩增及序列
  A: CsHXK2启动子PCR扩增产物电泳图; B: CsHXK2启动子序列。
  
• 图2 茶树CsHXK2蛋白亚细胞定位
  A~C和H~K: 35S::sGFP; D~G: 35S::CsHXK2::sGFP; L~O: 35S::CsHXK2-cTP::sGFP。A, D, H, L: GFP绿色荧光信号; E: 叶绿素自发荧光; I, M: 细胞核RFP红色荧光信号; B, F, J, N: 明场; C, G, K, O: 信号融合。
  
• 图3 CsHXK2蛋白酵母功能互补验证
  A: ddH₂O; B: 2%半乳糖; C: 2%葡萄糖; D: 2%果糖; E: 酵母转化片段电泳检测。
  
• 图4 茶树CsHXK2基因的组织特异性表达模式
  A: 春季‘龙井43’不同组织; B: 秋季‘龙井43’不同组织; C: ‘舒茶早’不同组织。柱上标以不同字母表示数据间的显著性差异(P < 0.05)。
  
• 图5 茶树CsHXK2基因在不同处理下的表达分析
  A: 自然冷驯化; B: 4℃低温及25℃恢复; C: 炭疽菌接种; D: 50 μmol L^-1外源GA₃处理。柱上标以不同字母表示数据间的显著性差异(P < 0.05)。*表示0.05水平显著; ***表示0.001水平显著。