茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析 作物学报    2020, 46 (10): 1628-1638.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94166

图2 茶树CsHXK2蛋白亚细胞定位
A~C和H~K: 35S::sGFP; D~G: 35S::CsHXK2::sGFP; L~O: 35S::CsHXK2-cTP::sGFP。A, D, H, L: GFP绿色荧光信号; E: 叶绿素自发荧光; I, M: 细胞核RFP红色荧光信号; B, F, J, N: 明场; C, G, K, O: 信号融合。

正文中引用本图/表的段落

A: CsHXK2启动子PCR扩增产物电泳图; B: CsHXK2启动子序列。

将携带35S::sGFP和35S::CsHXK2::sGFP载体的农杆菌注射至烟叶片内。经显微镜观察发现, 注射空载体的叶片在细胞质、细胞膜、细胞核内均具有GFP绿色荧光信号(图2-A, C); 含有CsHXK2融合GFP蛋白的叶片, 细胞内的绿色荧光(图2-D)可以与叶绿素自发红色荧光(图2-E)相互重叠, 呈现出黄色荧光信号(图2-G)。随后, 我们将去除N末端叶绿体转运肽的CsHXK2蛋白融合GFP表达载体(即35S:: CsHXK2-cTP::sGFP)注射至含有RFP核定位marker的烟草叶片内发现, 含有CsHXK2-cTP融合GFP蛋白的叶片与含有空载体的叶片所发射的绿色荧光信号具有相同的来源(图2-L, O, H, K), 即来源于细胞质、细胞膜、细胞核。表明CsHXK2蛋白定位于叶绿体, 且其蛋白质序列上存在的N末端叶绿体转运信号肽对其定位起到了决定性的作用。

与茶树CsHXK2关系密切的亲缘蛋白有拟南芥AtHXK3、水稻OsHXK4、烟草NtHXK2及番茄LeHXK4, 均属于具有叶绿体转运肽的type A类HXKs[19], 且均作用于叶绿体基质[10,12,28-29]。基于酵母己糖激酶功能缺失互补试验发现, LeHXK4全长蛋白不能磷酸化葡萄糖和果糖, 但其去除叶绿体转运肽的成熟蛋白能磷酸化葡萄糖和果糖; 而利用酶活动力学试验发现, LeHXK4具有葡萄糖和果糖磷酸化活性[29]。因此, 转化LeHXK4的酵母突变体不能利用己糖为碳源, 主要是由于叶绿体转运肽所引起的蛋白细胞内定位而造成, 转运肽本身并没有改变酶的催化活性。本研究中, CsHXK2蛋白定位于叶绿体(图2-D和G)内, 具有叶绿体转运肽的CsHXK2蛋白仅能以磷酸化葡萄糖为碳源, 而去除转运肽的CsHXK2成熟蛋白则能催化葡萄糖和果糖为碳源(图3-C和D)。说明CsHXK2成熟蛋白具备己糖磷酸化活性, 而完整CsHXK2蛋白的催化能力仍有待用酶活试验进行进一步的探究。

本文的其它图/表

• 表1 引物信息
  
• 图1 茶树CsHXK2基因启动子扩增及序列
  A: CsHXK2启动子PCR扩增产物电泳图; B: CsHXK2启动子序列。
  
• 表2 茶树CsHXK2基因启动子的主要顺式作用元件
  
• 图3 CsHXK2蛋白酵母功能互补验证
  A: ddH₂O; B: 2%半乳糖; C: 2%葡萄糖; D: 2%果糖; E: 酵母转化片段电泳检测。
  
• 图4 茶树CsHXK2基因的组织特异性表达模式
  A: 春季‘龙井43’不同组织; B: 秋季‘龙井43’不同组织; C: ‘舒茶早’不同组织。柱上标以不同字母表示数据间的显著性差异(P < 0.05)。
  
• 图5 茶树CsHXK2基因在不同处理下的表达分析
  A: 自然冷驯化; B: 4℃低温及25℃恢复; C: 炭疽菌接种; D: 50 μmol L^-1外源GA₃处理。柱上标以不同字母表示数据间的显著性差异(P < 0.05)。*表示0.05水平显著; ***表示0.001水平显著。