茶树己糖激酶基因CsHXK2的启动子克隆及表达特性分析 作物学报    2020, 46 (10): 1628-1638.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.94166

图3 CsHXK2蛋白酵母功能互补验证
A: ddH₂O; B: 2%半乳糖; C: 2%葡萄糖; D: 2%果糖; E: 酵母转化片段电泳检测。

正文中引用本图/表的段落

本研究将CsHXK2::pDR196、CsHXK2-cTP::pDR196酵母表达载体以及空载体pDR196分别转化至缺乏己糖激酶(hxk1/hxk2/glk1)活性的酵母三重突变体YSH7.4-3C, 转化片段经酵母菌液PCR和电泳跑胶验证正确(图3-E)。点板试验结果显示, 转化空载体、CsHXK2和CsHXK2-cTP的酵母均可在无碳源而仅有yeast nitrogen base、-Ura DO Supplement、琼脂成分的培养基上进行缓慢生长(图3-A), 而在含半乳糖为碳源的培养基上迅速生长(图3-B); 在含葡萄糖为碳源的培养基上, 转化CsHXK2-cTP的酵母长势显著优于转化CsHXK2的酵母, 且二者长势明显优于转化空载体pDR196的酵母(图3-C); 在含果糖为碳源的培养基上, 转化CsHXK2的酵母与转化空载体pDR196的酵母生长势相似, 而转化CsHXK2-cTP的酵母长势显著性优于二者(图3-D)。说明CsHXK2蛋白具有的叶绿体转运肽能显著影响其磷酸化催化活性; CsHXK2成熟蛋白可以磷酸化葡萄糖和果糖。

与茶树CsHXK2关系密切的亲缘蛋白有拟南芥AtHXK3、水稻OsHXK4、烟草NtHXK2及番茄LeHXK4, 均属于具有叶绿体转运肽的type A类HXKs[19], 且均作用于叶绿体基质[10,12,28-29]。基于酵母己糖激酶功能缺失互补试验发现, LeHXK4全长蛋白不能磷酸化葡萄糖和果糖, 但其去除叶绿体转运肽的成熟蛋白能磷酸化葡萄糖和果糖; 而利用酶活动力学试验发现, LeHXK4具有葡萄糖和果糖磷酸化活性[29]。因此, 转化LeHXK4的酵母突变体不能利用己糖为碳源, 主要是由于叶绿体转运肽所引起的蛋白细胞内定位而造成, 转运肽本身并没有改变酶的催化活性。本研究中, CsHXK2蛋白定位于叶绿体(图2-D和G)内, 具有叶绿体转运肽的CsHXK2蛋白仅能以磷酸化葡萄糖为碳源, 而去除转运肽的CsHXK2成熟蛋白则能催化葡萄糖和果糖为碳源(图3-C和D)。说明CsHXK2成熟蛋白具备己糖磷酸化活性, 而完整CsHXK2蛋白的催化能力仍有待用酶活试验进行进一步的探究。

本文的其它图/表

• 表1 引物信息
  
• 图1 茶树CsHXK2基因启动子扩增及序列
  A: CsHXK2启动子PCR扩增产物电泳图; B: CsHXK2启动子序列。
  
• 表2 茶树CsHXK2基因启动子的主要顺式作用元件
  
• 图2 茶树CsHXK2蛋白亚细胞定位
  A~C和H~K: 35S::sGFP; D~G: 35S::CsHXK2::sGFP; L~O: 35S::CsHXK2-cTP::sGFP。A, D, H, L: GFP绿色荧光信号; E: 叶绿素自发荧光; I, M: 细胞核RFP红色荧光信号; B, F, J, N: 明场; C, G, K, O: 信号融合。
  
• 图4 茶树CsHXK2基因的组织特异性表达模式
  A: 春季‘龙井43’不同组织; B: 秋季‘龙井43’不同组织; C: ‘舒茶早’不同组织。柱上标以不同字母表示数据间的显著性差异(P < 0.05)。
  
• 图5 茶树CsHXK2基因在不同处理下的表达分析
  A: 自然冷驯化; B: 4℃低温及25℃恢复; C: 炭疽菌接种; D: 50 μmol L^-1外源GA₃处理。柱上标以不同字母表示数据间的显著性差异(P < 0.05)。*表示0.05水平显著; ***表示0.001水平显著。