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作物学报 ›› 2021, Vol. 47 ›› Issue (12): 2371-2378.doi: 10.3724/SP.J.1006.2021.01094

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病毒介导的GFP-ATG8在小麦上的表达和在自噬活性监测上的应用

胡蕊洁(), 杨向芸, 贾磊, 李玉如, 项月, 岳洁瑜, 王华忠*()   

  1. 天津师范大学生命科学学院 / 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387
  • 收稿日期:2020-12-07 接受日期:2021-04-14 出版日期:2021-12-12 网络出版日期:2021-05-13
  • 通讯作者: 王华忠
  • 作者简介:E-mail: 1124144490@qq.com
  • 基金资助:
    国家自然科学基金项目(31971829);天津市高校中青年骨干创新人才培养计划(135305JF78);天津师范大学中青年教师学术创新推进计划(1353P2XC1604)

Virus-mediated expression of GFP-ATG8 for autophagy monitoring in wheat

HU Rui-Jie(), YANG Xiang-Yun, JIA Lei, LI Yu-Ru, XIANG Yue, YUE Jie-Yu, WANG Hua-Zhong*()   

  1. School of Life Sciences, Tianjin Normal University / Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387, China
  • Received:2020-12-07 Accepted:2021-04-14 Published:2021-12-12 Published online:2021-05-13
  • Contact: WANG Hua-Zhong
  • Supported by:
    National Natural Science Foundation of China(31971829);Knowledge Innovation and Training Program of Tianjin(135305JF78);Knowledge Innovation Program of Tianjin Normal University(1353P2XC1604)

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摘要：

自噬相关因子ATG8定位于自噬结构的膜上, 荧光蛋白标记的ATG8在过表达细胞内所呈现的点状荧光常用于表征自噬结构和监测自噬活性。病毒介导的过表达(virus-mediated over-expression, VOX)是一种简便、快速制备目的基因过表达植株的技术。采用基于狗尾草花叶病毒FoMV的VOX技术(FoMV-VOX)在小麦植株中表达GFP标记的小麦ATG8家族成员TaATG8a, 建立小麦活体植株的自噬活性监测技术平台。构建了融合基因GFP-TaATG8a的FoMV-VOX载体, 采用Agroinfiltration方法在本氏烟草叶片中表达携带GFP-TaATG8a的FoMV基因组RNA和组装病毒粒子, 将烟草汁液中的病毒粒子摩擦接种于小麦幼苗植株叶片, 对接种植株叶片和根组织中的荧光信号进行观察和特征鉴定。结果表明, 采用FoMV-VOX技术在小麦植株上不仅可以实现GFP-TaATG8a在接种叶片中的高效表达, 还可以借助病毒的系统侵染实现该融合基因在未接种叶片和根组织中的高效表达。经饥饿处理激活自噬, 融合蛋白GFP-TaATG8a在植株叶表皮、叶肉以及根细胞中呈现表征自噬结构的点状荧光。采用FoMV-VOX技术获得的GFP-TaATG8a过表达植株可以应用于小麦多种组织类型中的自噬活性调节机制和生理功能研究。

关键词: 小麦, 病毒介导的过表达, ATG8, 细胞自噬

Abstract:

ATG8 is an essential autophagy-related factor decorating on the membranes of autophagic structures. Fluorescence protein-tagged ATG8 expressed in live cells has been widely used to visualize autophagic structures and to monitor the activity of autophagy. Virus-mediated over-expression (VOX) is a simple technique for rapid expression of genes of interest in plants. Here the foxtail mosaic virus (FoMV)-based VOX was adopted for preparation of wheat seedlings over-expressing the GFP-tagged form of the wheat ATG8 family member TaATG8a. An FoMV-VOX vector was constructed for expression of the recombinant FoMV genomic RNA carrying the GFP-TaATG8a sequence. Expression of FoMV genomic RNA and assembly of FoMV virions were accomplished in Nicotiana benthamiana leaves through agroinfiltration. N. benthamiana leave extract containing FoMV virions was used to inoculate leaves of wheat seedlings. Fluorescence microscopy of virus-inoculated wheat seedlings showed the efficient expression of GFP-TaATG8a was in not only inoculated leaves but also systemic uninoculated leaves and roots. Moreover, punctate fluorescence of GFP-TaATG8a representing autophagic structures was clearly observed in leaf epidermal cells, mesophyll cells, and root cells of wheat seedlings subjected to autophagy-stimulating starvation stress. The autophagy activity in these cells could be evaluated by quantifying the GFP-TaATG8a-labeled autophagic structures. These results lay a foundation for studies of the regulating mechanisms and physiological roles of autophagy in various wheat tissues.

Key words: wheat (Triticum aesticum L.), virus-mediated over-expression (VOX), ATG8, autophagy

图1

融合基因GFP-TaATG8a的VOX载体T-DNA序列示意图 LB和RB: T-DNA的左边界和右边界序列; P35S: CaMV 35S启动子序列; Tnos: Nos终止子序列; 标有数字1、2、3、4和字母CP的白色框分别表示FoMV的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4和外壳蛋白(coat protein)基因。"

图2

FoMV介导的GFP和GFP-TaATG8a在烟草上的表达 将GFP或GFP-TaATG8a的VOX载体导入农杆菌, 采用Agroinfiltration方法转化烟草叶片。对照(CK)烟草叶片注射不含农杆菌的MMA溶液。转化7 d后在荧光显微镜下观察GFP荧光。标尺为100 μm。"

图3

FoMV介导的GFP和GFP-TaATG8a在小麦叶片中的表达 将表达GFP和GFP-TaATG8a的烟草叶片汁液摩擦接种于二叶期小麦幼苗第2叶, 对照(CK)植株摩擦的汁液来自注射MMA溶液的对照烟草植株叶片。分别于接种后第7天和20天观察第2叶和第3叶中的GFP荧光。标尺为500 μm。"

图4

FoMV介导的GFP和GFP-TaATG8a在小麦根组织中的表达 将表达GFP和GFP-TaATG8a的烟草叶片汁液摩擦接种于二叶期小麦幼苗第2叶, 对照(CK)植株摩擦的汁液来自注射MMA溶液的对照烟草植株叶片。于接种后第20天观察根中的GFP荧光。标尺为500 μm。"

图5

融合蛋白GFP-TaATG8a在烟草叶表皮细胞中的定位 从过表达GFP或GFP-TaATG8a的烟草植株叶片背面注射100 μmol L-1 E-64D (+E-64D)或1%溶剂DMSO (-E-64D), 将注射后的叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理。于处理后24 h在共聚焦显微镜下观察表皮细胞中的GFP荧光并照相。标尺为50 μm。"

图6

融合蛋白GFP-TaATG8a在小麦叶表皮细胞中的定位 从过表达GFP或GFP-TaATG8a的小麦植株叶片背面主脉切口处注射100 μmol L-1 E-64D (+E-64D)或1%溶剂DMSO (-E-64D), 将注射后的叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理。于处理后24 h在共聚焦显微镜下观察叶表皮细胞中的GFP荧光并照相。标尺为20 μm。"

图7

融合蛋白GFP-TaATG8a在小麦叶肉细胞中的定位 从过表达GFP或GFP-TaATG8a的小麦植株叶片背面主脉切口处注射100 μmol L-1 E-64D (+E-64D)或1%溶剂DMSO (-E-64D), 将注射后的叶片剪下置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行离体饥饿处理。于处理后24 h在共聚焦显微镜下观察叶肉细胞中的GFP荧光并照相。标尺为20 μm。"

图8

融合蛋白GFP-TaATG8a在小麦根细胞中的定位 将过表达GFP-TaATG8a小麦植株的根部剪下, 置于蒸馏水中并保存于黑暗条件下进行饥饿处理, 蒸馏水中添加终浓度1 μmol L-1的刀豆素A (Starvation/ConA)或1%溶剂DMSO (Starvation/-), 同时设置不经饥饿和刀豆素A处理的非离体根组织对照(-/-)。于处理后24 h在共聚焦显微镜下观察根细胞中的GFP荧光并照相。标尺为75 μm。"

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