为探究缺乏功能性NAM-B1基因的野生二粒小麦渗入系BAd7-209拥有高籽粒蛋白含量(grain protein content, GPC)的遗传基础, 本研究以BAd7-209 (川农1号饲草麦)为父本, 分别与低蛋白含量的高产弱筋小麦品种川育27 (CY27)和川农16 (CN16)杂交构建重组自交系(recombinant Inbred Line, RIL) F6:8定位群体和F6验证群体, 进行高籽粒蛋白含量的QTL定位分析。连续2年4个环境及最佳线性无偏预测下的均值, BAd7-209的GPC达15.35%, 极显著高于CY27的12.30%, 千粒重(thousand-grain weight, TGW)达46.08 g, 极显著低于CY27的50.53 g, RIL群体的平均GPC和TGW分别为14.01%和52.02 g, 均显著高于其母本和父本, 表明BAd7-209的高GPC和CY27的高TGW优异特性均高效地传递到了RIL群体中, 有效避免了浓度效应对GPC客观评价的干扰。通过16K SNP芯片分析共检测出5个与GPC相关的QTL, 可解释9.68%~29.17%的表型变异。其中, 来源于BAd7-209的新主效位点QGPC.sicau- YZ-6BS贡献率变异幅度为9.68%~29.17%, 开发的KASP (kompetitive allele specific PCR, KASP)标记证明携带该增效位点株系的GPC在所有环境下和不同遗传背景下均极显著高于不携带该位点的株系, 在定位和验证群体中平均增幅分别达17.89%和41.20%。同时, 从RIL定位群体中选育到13个品质、农艺、抗病综合性状优良的小麦新种质, 其GPC和TGW分别高达13.99%~18.08%和45.20~57.69 g。这些基因资源对优质高产小麦遗传研究与育种应用具有重要意义。